蛋白质是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。

一、质谱分析蛋白的方法

用于质谱分析蛋白质的方法主要有三种：肽质量指纹图谱法（PMF）、串联质谱法（CID）和梯形肽片段测序法（ladderpeptidesequencing）。

1.肽质量指纹图谱（PMF）

肽质量指纹图谱（PMF）即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白质切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽的相对分子质量，将所得的蛋白酶解肽段质量数在相应的数据库中检索，寻找相似肽指纹谱，从而绘制“肽图”。由此可见，分子质量的精确度是PMF的关键指标所在，但蛋白质的翻译后修饰可能使PMF的质量数与理论值不符，故这就需要与序列信息适当结合。

2.串联质谱法（CID）

串联质谱法（CID）是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳定离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基。串联质谱的肽序列图需要读出部分氨基酸序列与前后的离子质量和肽段母质量相结合，这种鉴定方法称为肽序列标签（PST）。

3.梯形肽片段测序法（ladderpeptidesequencing）

梯形肽片段测序法（ladderpeptidesequencing），与Edman法有相似之处，是用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，产生包含仅异于1个氨基酸残基质量的系列肽，名为ladder，经质谱检测，由相邻肽峰的质量差而得知相应氨基酸残基。其中的问题是由于酶解速度不一，易受干扰。

二、蛋白质质谱分析法的研究进展

自约翰·芬恩和田中耕一发明了确认生物大分子结构的分析方法及其质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施，已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一。质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：灵敏度高，能为亚微克级试样提供信息；能最有效地与色谱联用；适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定；同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。

1.质谱分析方法与蛋白质分析的联系

蛋白质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，其复杂结构主要包括一级、二级、三级或四级结构。目前蛋白质测定主要是指针对蛋白质一级结构包括分子量、肽链氨基酸（二级结构）及多肽或二硫键数目和位置（三级结构）作出量效关系确定。

近年来，涌现出较为成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术，其主要有：（1）电喷雾电离质谱（Electrosprayioni-sation，ESI-MS）；（2）基质辅助激光解析电离质谱（Matrixas-sistedlaserdesorption/ionization，MALDI）；（3）快原子轰击质谱；（4）离子喷雾电离质谱；（5）大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前3种研究得最多，应用得也最广泛。现代研究结果发现，越来越多的小肽与蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷，如测序速度较慢、样品用量较大、对样品纯度要求很高、对于修饰氨基酸残基往往会错误识别而对N末端保护的肽链则无法测序。C末端化学降解测序法则由于无法找到异硫氰酸苯酯（PITC）这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。由于蛋白降解为多肽技术的提升以及质谱测定的飞速发展，使得质谱广泛应用于蛋白质的分析和测定。近年来随着ESI-MS及MALDI等质谱软电离技术的发展与完善，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100kDa，使蛋白质分子测定成为可能。目前基质辅助激光解析电离/飞行时间质谱法（MALDI-TOF/MS）已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一。目前蛋白质组研究为蛋白质提供了一级结构（序列）谱库，能为解析FAST（超高速）谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据。

三、蛋白质质谱分析的应用

有研究表明，用MALDI-TOF质谱分析蛋白质最早一例是于1988年提出用紫外激光以烟酸为基质在TOF上测出质量数高达60kDa的蛋白质，精确度开始只有0.5％，后改进到0.1％～0.2％。质谱技术主要用于检测双向凝胶电泳或“双向”高效柱层析分离所得的蛋白质及酶解所得的多肽的质量，也可用于蛋白质高级结构及蛋白质间相互作用等方面的研究，3条肽段的精确质量数便可鉴定蛋白质。MALDI-TOF/MS以及ESI-MS可以清楚地解析蛋白质多肽的一级结构。

近年来，FABMS-MS发展突飞猛进，推动了蛋白质多肽二级结构的测定，其数据采集方面的自动化程度、检测的敏感性及效率都大大提高。其主要是通过MS-MS的方式将2个以上质谱仪器进行联合运用，采用前质谱选择特定肽段，破坏后进行后续质谱的分析，可以有效实现二级质谱对蛋白质的分析。大规模数据库和一些分析软件（如SEQUEST）的应用使得FABMS-MS可以进行更大规模的测序工作，

如采用2D电泳及MS技术对整个酵母细胞裂解产物进行分析，已经鉴定出1484种蛋白质，包括完整的膜蛋白和低丰度的蛋白质；分析肝细胞癌患者血清蛋白质组成分，并利用质谱鉴定磷酸化蛋白及采用质谱技术研究许旺细胞源神经营养蛋白（SDNP）的分子结构等。

科学工作者通过多种方式收集蛋白质的结构信息将其绘制成为肽质量指纹图谱，可以有效地分析蛋白性质，为医学、生命科学提供信息支持。如目前通过分离手段以及质谱联合手段发现的组织蛋白酶B、热急蛋白27、mRNA连接蛋白P62等对癌症治疗起到了非常重要作用。广泛地采用多种分离手段联合质谱对生物大分子进行全面的精确的分析取得了突出成效。如采用双向凝胶电泳-质谱测定技术、液质联用（HPLC-MS）、气质联用（GC-MS）、ESI-MS测量法、FABMS-MS方法进行蛋白质分析；如采用HPLC-MS/MS对卵巢癌患者血液中的肿瘤标志蛋白质CA125进行测定具有治疗学价值。另外继人类基因组学（HGP）之后，目前又一个重大世界课题即蛋白质组学（Proteomictechniques）得到了人们广泛的关注，蛋白质组学广泛地应用于医学和生命科学领域。

我国目前开展了“人类肝脏蛋白质组学及毒理学研究”，其中测定蛋白质主要手段中以质谱居于首位，其次为凝胶图像分析、蛋白质和多肽的N端、C端测序及氨基酸组成分析等，由此可看出质谱分析在蛋白质组学的定量以及结构和指纹鉴定中有着了无可取代的地位。在蛋白质的质谱分析中，质谱的准确性对测定结果有很大影响，因此质谱测序现在仍很难被应用于未知蛋白的序列测定。肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、用量少、易操作等优点，这些都非常适合于现在科学研究的需要。

随着各种衍生化方法和酶解方法的不断改进，蛋白双向电泳的应用以及质谱技术的不断完善，质谱将会成为多肽和蛋白质分析最有威力的工具之一。但也要清醒地认识到，质谱的灵敏度虽然高，但仍然难解决细胞组织痕量调控蛋白游离显示的问题，此外质谱的发展导致质谱仪价格非常昂贵。所以，需要积极地解决质谱自身发展的关键技术，才能使质谱在蛋白质分析中的作用更加的优化和凸显。离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、

电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：首先实现蛋白降解成多肽，通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（m/z值）的多肽离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的m/z值，分析鉴定未知蛋白质。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而备受科学家的广泛注意。

1.傅立叶变换-离子回旋共振质谱法在蛋白质分析中的应用

传统上,蛋白质的鉴定是从头测序,多数是自动的逐步的化学降解(Edman降解)蛋白质,然后分离多肽片段。这些局部顺序依靠重叠的片段拼装组合出整个蛋白质的顺序,但是更多的用于探针从基因库分离出编码该蛋白的基因。随着序列数据库的增大,很明显,即使相对较短或不完善的序列(缺口,模糊的残基)对蛋白质的鉴定都是很有用的。当意识到质谱能比较理想的产生期望的数据时,用从蛋白质或多肽提取的信息和序列数据库相关联的方法,而不是从头测序进行蛋白质鉴定的观念已经逐渐地深入心。

2.准确质量测定对蛋白质结构分析的应用价值

氨基酸顺序测定的第一步就是蛋白质分子量的确定,这能为测定蛋白质分子中多肽链的数目和用质谱方法测定各个肽段的氨基酸顺序提供最基础的数据。质量准确性的提高不仅能提高数据库搜索的速度,还能大大提高鉴定的可信度。

用丰度为99%的13C标记物培养基培养细菌,使磷脂中的12C被13C所取代,一旦C原子数已知,有n个碳原子质量数就会增加n,比较分别用ESIöFTöICRMS和(CID)FTöICRMS测得的天然和99%丰度的13C标记物培养基中磷脂的谱图,准确质量测定使其元素组成为唯一的可能。Demirev等组合使用完整蛋白质的准确质量测定和蛋白组数据库,显著提高了鉴定微生物的特异性。

He等最近组合使用了高的磁场(9.4T),大的Penning阱的直径(101.6mm)及低的离子浓度,用L2ESIöFTöICRMS检测两种肽时质量分辨能力很高,这有可能成为蛋白组学研究的新突破点。ESIöFTöICRMS的准确质量测定还能可信的证实不确定的离子组成。

3.蛋白质分子中氨基酸序列的测定

蛋白质一级结构测定的一个最灵敏和最普遍的方式就是先用二维聚乙酰胺凝胶电泳分离蛋白质混合物,以胰蛋白酶消解,质量分析(分辨和分离一个特别的肽段)并最终用质谱方法产生一个至少是部分的氨基酸一级结构。

肽质量图谱(Peptidemassmapping)是蛋白质一级结构测定一种最常用的手段。肽质量图谱是基于序列特异性蛋白酶水解蛋白质衍生出来的肽的一个基团的准确质量的测定,是蛋白质鉴定的一个高效的方法。

不同氨基酸序列的蛋白质用序列特异性的蛋白酶水解后将会产生一系列该蛋白独特的质量指纹。因此,如果用选择好的质量数(观察到的肽质量指纹)在一个包含有该特异蛋白的序列数据库中搜索,该蛋白就能依赖这个数据库正确的鉴定了。

采用纳流量液相色谱与傅立叶变换2离子回旋共振质谱联用,提供了一系列的胰蛋白酶消解后的母离子和子离子的质量,质量的准确性达到了10^-6数量级,从而进一步确证了人肝的三种二乙酰基还原酶。另外采用n2ESIöFTöICRMS在pmol数量级的灵敏度上获得了蛋白质消解物的准确的质量指纹图谱,缩小了数据库的搜索范围并降低了搜索的噪声,测得了该种乙醛氧化酶的序列。应用ESIöFTöICRMS和红外多光子解离(IRmultiphotondissociation,IRMPD)可对一种糖激酶进行分子量和肽的一级结构的精确测定。