2019年1月8日，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心陈兴教授课题组在Nature Chemical Biology杂志在线发表了题为“Legionella effector SetA as a general O-glucosyltransferase for eukaryotic proteins”（DOI: 10.1038/s41589-018-0189-y）的研究论文，报道通过化学酶法标记策略，实现了对嗜肺军团菌效应蛋白糖基转移酶SetA的蛋白底物鉴定，并阐明了SetA的底物选择机理，为糖蛋白的人工合成提供了一种有力的工具。

糖基化修饰是一种广泛存在且重要的蛋白质翻译后修饰，由糖基转移酶催化形成。抗体、疫苗等许多临床治疗性蛋白质都具有特异性糖基化修饰，且对蛋白活性至关重要。基于糖基转移酶的化学酶法合成方法，是获得均一糖蛋白的有效手段之一。因此，寻找性质优良的各种糖基转移酶十分关键。对比真核细胞，细菌来源的糖基转移酶具有易表达纯化和催化产率高等优良性质，常被改造为人工合成糖蛋白的工具酶。然而，蛋白O-连接糖基化修饰在原核生物与真核生物之间并不保守，这成为了利用细菌糖基化系统生产真核生物O-糖蛋白的一大瓶颈。为了解决这个问题，陈兴教授课题组对病原菌-宿主相互作用中的蛋白质糖基化进行了探索。

某些病原菌入侵宿主细胞后，会分泌具有糖基转移酶活性的效应蛋白。这些效应蛋白往往利用宿主的糖供体，并且修饰宿主的靶蛋白。因此，对这类糖基转移酶的工程化，可为实现真核生物O-糖蛋白的合成提供新的有效策略。嗜肺军团菌效应蛋白SetA具有O-葡萄糖转移酶活性，然而其底物蛋白尚未被鉴定。陈兴课题组首先开发了能够实现特异性标记和选择性富集的化学酶法策略。他们设计被SetA利用的生物正交基团修饰的糖供体（尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖，UDP-6AzGlc），将叠氮葡萄糖6AzGlc转移至底物蛋白。课题组通过点击化学反应，与可切割生物素探针连接，实现对底物蛋白的选择性富集和位点特异性质谱鉴定(下图)。质谱分析鉴定到分布于276个蛋白的317个O-glucose修饰位点。天然糖供体标记及军团菌侵染实验，验证了SetA可以修饰众多的底物蛋白。

化学酶法标记策略流程示意图

进一步研究发现被修饰蛋白具有S/T#-X-L-P/G（#为修饰氨基酸）序列保守性。核心催化结构域的结构模型表面，糖供体结合口袋邻近处的疏水区域参与了SetA的底物选择。随后，研究人员将SetA选择性识别的S/T-X-L-P/G保守性序列，开发为O-glucosylation标签 （GlcTag），实现了真核生物蛋白的位点特异性O-糖基化修饰(下图)。

SetA识别S/T-X-L-P/G保守序列

综上所述，这项研究开发了化学酶法标记策略，实现了对军团菌效应蛋白糖基转移酶SetA的底物蛋白鉴定，揭示了SetA的底物修饰具有S/T-X-L-P/G序列选择性。该研究首次发现了原核生物中广谱O-糖基化系统，为糖蛋白的人工合成提供了有力的工具。该化学酶法标记富集策略可推广应用到多种糖基转移酶的底物蛋白鉴定，促进更多的糖合成工具酶的开发，进而实现各种糖蛋白的精准合成。

北大-清华生命科学联合中心博士研究生高玲为本论文第一作者。陈兴教授为通讯作者。北大化学院来鲁华教授、北京生命科学研究所邵峰研究员和北大生科院肖俊宇研究员参与了该研究。该研究工作得到了国家自然科学基金委、科技部、北大-清华生命科学联合中心的资助。